鈦具有良好的生物相容性和力學性能，已廣泛應用于牙種植、整形等醫(yī)學領域。但鈦是生物惰性材料，需要對其表面進行仿生化修飾，才能達到加速愈合，提高骨結合率的目的。鈦表面仿生化修飾的方法種類繁多，其中表面引入納米膜層是最常用的方法。制備納米膜層的方法包括:L-B膜(Langmuir-Blodgett film)技術、旋涂法(spin coating)、離子濺射法(spraying)、化學沉積法(chemical deposition)、電沉積法(electrodeposition)以及層層自組裝(layer-by-layer assembly,LbL)技術。關于層層自組裝技術的近年研究較多，其在生物科學中主要應用于酶、蛋白質(zhì)、DNA等生物分子自組裝膜。這些生物分子自組裝膜被廣泛應用于醫(yī)用生物材料領域，成為實現(xiàn)生物材料表面功能設計的有效手段[1]。現(xiàn)就層層自組裝技術的概念及特點、鈦表面聚電解質(zhì)膜的結構以及影響聚電解質(zhì)膜形成的因素及應用進行綜述。
一、層層自組裝技術的概念
Decher和Hong[2]于1991年提出層層自組裝技術，即基于靜電相吸原理，聚電解質(zhì)陰陽離子間相互作用而產(chǎn)生的自我組裝技術，其所形成的多層膜也稱聚電解質(zhì)多層膜(polyelectrolyte multi-layer films,PEM)。具體而言即為將帶電荷的基材表面連續(xù)交替浸沒于帶相反電荷的電解質(zhì)溶液中，利用靜電相吸作用，使帶不同電荷的兩種物質(zhì)有序而緊湊地連接在一起，重復數(shù)次得到多層膜結構[3]。這種技術可在分子水平上改變鈦表面性質(zhì)，為鈦表面改性提供新途徑。
聚電解質(zhì)膜具有如下特點:①能將蛋白質(zhì)、多聚糖、磷脂、DNA等功能性物質(zhì)固定于鈦金屬表面[4-8]；實現(xiàn)表面裝載生物因子的緩釋[9]。②制備工藝簡單、溫和、無需特殊設備，不受基材形狀的限制。③制備的薄膜具有良好的力學和化學穩(wěn)定性；薄膜的組成和厚度可控。
二、鈦表面聚電解質(zhì)膜的組成
鈦表面經(jīng)層層自組裝技術制備的聚電解質(zhì)膜可分為基底層、引發(fā)層、正負電荷聚電解質(zhì)層。
1.鈦表面堿性碳酸鹽基底層
鈦表面缺乏用于自組裝的正負電荷，需用強酸、強堿或堿熱等各種處理引入足夠的正或負電荷。堿熱處理是使鈦表面帶負電荷的經(jīng)典方法[10]：羥基與水合氧化鈦反應形成表面帶負電荷的堿性鈦酸鹽水凝膠層，加熱后水凝膠層去水化形成致密穩(wěn)定的堿鈦晶體層，其表面的負電荷即可用于后續(xù)的聚電解質(zhì)層層自組裝。此外，經(jīng)堿熱處理后，鈦表面形成的水凝膠層具有納米微孔，可提高比表面積，以組裝更多的聚電解質(zhì)。
2.引發(fā)層
已有研究認為，在帶負電荷的堿熱處理后的鈦表面引入一層穩(wěn)定的帶正電荷聚電解質(zhì)層作為引發(fā)層，可引發(fā)弱電解質(zhì)的有序吸附[11-12]。常作為引發(fā)層的聚電解質(zhì)有聚賴氨酸、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)、殼聚糖等。
3.聚電解質(zhì)層
聚電解質(zhì)有不同分類方法。根據(jù)聚電解質(zhì)所帶電荷不同，可分為帶正或負電荷的聚電解質(zhì)。根據(jù)來源可分為人工合成和天然聚電解質(zhì)。人工合成類主要有：聚二烯丙基二甲基氯化銨[poly(dimethyldiallylammonium chloride),PDDA]、聚丙烯酸甲酯[poly(methacrylic acid),PMA]、聚苯乙烯硫酸鹽[poly(styrenesulfonate),PSS]、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、PEI等；天然類主要有：核酸、蛋白質(zhì)、海藻酸鹽、硫酸軟骨素、多聚糖、肝素、透明質(zhì)酸、殼聚糖、纖維素硫酸酯、葡聚糖硫酸酯、羧甲基纖維素[3]。鈦表面層層自組裝改性多采用生物相容性好的天然聚電解質(zhì)。
(1)帶正電荷的聚電解質(zhì)
聚賴氨酸是一種陽離子聚氨基酸，多肽結構使其具有良好的生物相容性。聚賴氨酸含有大量氨基，去質(zhì)子化后帶正電荷，可通過離子相互作用吸附聚陰離子，因此能充當鈦表面層層自組裝中帶正電荷的聚電解質(zhì)層。已有研究顯示，以聚賴氨酸作為鈦表面基底層，通過靜電相互作用引入肝素-膠原自組裝膜，可顯著提高鈦表面的抗凝血性能[12]。
殼聚糖是一種直鏈陽離子多糖，由β-(1,4)糖苷單元連接組成，這些糖苷單元上還隨機帶有N-乙酰基結構，因而殼聚糖具有糖胺多糖和透明質(zhì)酸的部分特點，有良好的生物相容性和低免疫原性[13]。許多研究證實殼聚糖是有效的、可控的基因載體。鈦表面層層自組裝改性，構建殼聚糖-質(zhì)粒DNA(人骨形成蛋白)聚電解質(zhì)膜，可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[14]。此外，殼聚糖具有抗菌作用，但機制并不十分清楚，有學者認為帶正電荷的殼聚糖與帶負電荷的微生物反應能起抗菌作用[15]。
膠原是一種兩性電解質(zhì)，在酸性條件下帶正電荷，其是細胞外基質(zhì)的框架結構，可借助細胞表面的特異性受體向細胞發(fā)出信號，通過細胞骨架或各種信號轉導途徑將信號傳導至細胞質(zhì)乃至細胞核，因此將膠原引入聚電解質(zhì)膜中能提高細胞在材料表面的黏附、增殖、分化、遷移等。
(2)帶負電荷的聚電解質(zhì)
肝素是一種聚陰離子氨基多糖，也是細胞外基質(zhì)的成分，可與多種生長因子結合，從而調(diào)控細胞行為[17]。已有研究顯示，鈦表面可成功構建殼聚糖-肝素多層聚電解質(zhì)膜結構，并促進成骨細胞的黏附、生長、增殖和分化[18]。肝素涂層由于具有抗凝血性和強親水性，適用作抗細菌黏附涂層[19]。
透明質(zhì)酸是一種重要的糖胺多糖，在生理環(huán)境中多以陰離子形式存在，是構成細胞外基質(zhì)組分的重要物質(zhì)，對調(diào)控成骨相關細胞的行為，促進骨形成、骨整合具有重要作用。Picart等[20]通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色的聚賴氨酸-透明質(zhì)酸交替組裝多層膜，發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸可在層間交換生長，而透明質(zhì)酸則始終保持固定的層狀結構，這種聚電解質(zhì)層的生長方式使多層膜的厚度呈現(xiàn)指數(shù)增長的性質(zhì)。
三、鈦表面聚電解質(zhì)膜的生長特性及影響因素
1.鈦表面聚電解質(zhì)膜的生長特性
隨著組裝層數(shù)增長，聚電解質(zhì)膜的質(zhì)量和厚度有線性增長和指數(shù)增長兩種方式：兩種聚電解質(zhì)間的相互作用僅限于層與層間的界面作用，不發(fā)生相互擴散，所形成的膜呈線性增長。這種膜生長速度較緩慢，形貌較光滑。強聚電解質(zhì)和大部分弱聚電解質(zhì)構建的聚電解質(zhì)膜遵循這種線性增長方式，如DNA與聚鹽酸烯丙胺、PEI、PDDA所形成的膜均呈線性增長方式[21]。聚電解質(zhì)的相互擴散運動和穿透是指數(shù)增長型聚電解質(zhì)膜的重要特征。這種膜生長速度較快，表面粗糙度較大。指數(shù)增長型多層膜大多出現(xiàn)于包含多糖或多肽的弱電解質(zhì)體系中，與聚電解質(zhì)的電荷密度密切相關[22]。指數(shù)增長型多層膜更穩(wěn)定，并可載入更多的生物活性分子[23-24]。
2.影響鈦表面聚電解質(zhì)膜的形成因素
聚電解質(zhì)膜生長的驅(qū)動力以靜電吸引力為主。影響鈦表面聚電解質(zhì)膜生長和性能的因素較多，如聚電解質(zhì)性質(zhì)、相對分子質(zhì)量、濃度、介質(zhì)離子濃度和pH值、組裝過程中溫度、吸附時間和清洗等。改變這些參數(shù)，可以調(diào)節(jié)膜的生長速度以及生長方式，從而控制膜的厚度和物理性質(zhì)。
每層膜對基質(zhì)或另一層膜的吸附需要足夠數(shù)量的離子鍵。典型靜電吸附自組裝過程中，聚電解質(zhì)的質(zhì)量濃度一般應＞1 g/L，隨著聚電解質(zhì)濃度的增加，單層膜的厚度也隨之增加[25]。改變電解質(zhì)介質(zhì)中鹽離子濃度和pH可以調(diào)節(jié)電解質(zhì)電荷密度，從而調(diào)節(jié)電解質(zhì)反應和膜的生長。改變?nèi)芤褐宣}離子濃度，可影響聚電解質(zhì)在溶液中的構象，使電解質(zhì)膜呈指數(shù)增長，增加膜厚度[26]。聚電解質(zhì)液中離子強度的提高可以起屏蔽靜電的作用，減弱正負強電解質(zhì)分子間的相互吸引。也有研究顯示，鹽離子濃度過高也可導致鹽離子在膜表面與電解質(zhì)離子競爭或完全取代電解質(zhì)離子，造成層層自組裝失敗[27]。目前鹽離子濃度對聚電解質(zhì)膜增長影響的機制并不十分清楚。
由于弱聚電解質(zhì)的pH敏感性，調(diào)節(jié)pH即能控制聚電解質(zhì)的電荷密度，影響聚電解質(zhì)性質(zhì)，調(diào)控發(fā)生吸附時聚電解質(zhì)的構象，從而達到控制多層膜內(nèi)部和表面的組分以及其他物理性質(zhì)的目的。另外，調(diào)節(jié)pH可調(diào)節(jié)多層膜的離子交聯(lián)程度，控制聚電解質(zhì)膜的黏彈性，從而進一步控制聚電解質(zhì)膜的彈性模量。
清洗步驟在組裝過程中十分重要，其不僅可清除膜表面每次吸附后殘留的液體、避免交叉污染，而且有助于已吸附的聚電解質(zhì)層的穩(wěn)定[28]。吸附時間的確定取決于聚電解質(zhì)的相對分子質(zhì)量、濃度以及攪拌操作[29]。
四、層層自組裝技術在鈦表面改性中的應用
1.鈦表面的生物大分子固定
鈦表面層層自組裝改性是一種有效固化、傳遞治療因子的方法。許多研究從細胞學、分子生物學角度證實：蛋白質(zhì)、多糖類生物大分子在鈦表面的固定，構建了穩(wěn)定的類細胞外基質(zhì)表面，具備良好的細胞相容性。目前報道的固定分子種類包括殼聚糖、膠原、生長因子、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、釉原蛋白等。學者最早在鈦表面制備殼聚糖-明膠聚電解質(zhì)膜，以提高生物相容性[30]。Chua等[31]將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列以化學鍵固定于殼聚糖-透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)膜，獲得了良好的黏附性能，并證實其可促進成骨細胞在鈦表面的黏附和增殖。纖連蛋白-殼聚糖在鈦金屬表面的自組裝改性能亦可促進成骨細胞的增殖、活性、DNA合成和分化作用[4]。生物力學實驗證實，鈦種植體表面引入殼聚糖-透明質(zhì)酸或殼聚糖-明膠層層自組裝膜可提高種植體的固位穩(wěn)定性[5]。
2.鈦表面原位基因的釋放
基于層層組裝聚電解質(zhì)和組裝方式的多樣性，多種陽離子如PEI、陽離子脂質(zhì)體、環(huán)糊精可通過預組裝和組裝的方式引入基因涂層設計中。這種在生物材料表面構建的DNA-陽離子聚合物層狀結構，不但可有效提高涂層的原位基因轉染效率，同時可作為DNA的緩釋儲庫，實現(xiàn)在鈦植入部位精確定位釋放DNA，對基因治療有重要意義。已有研究證實，聚賴氨酸-DNA層層自組裝改性，可有利于鈦表面蛋白的吸附和生物礦化，有效提高鈦表面生物活性[32]。鈦表面的殼聚糖-DNA聚電解質(zhì)膜可持續(xù)原位誘導前成骨細胞向成骨細胞分化[33]。殼聚糖、聚賴氨酸具有良好的生物降解性，含有質(zhì)粒DNA的多層膜在生理條件下被酶降解，釋放質(zhì)粒DNA轉染細胞，使細胞持續(xù)表達生物活性靶蛋白，從而達到治療目的。
3.細胞生物學行為的調(diào)控
聚電解質(zhì)多層膜可改變鈦表面的物理化學性能，從而調(diào)控細胞生物行為。種植體植入后，細胞在鈦表面的黏附是細胞生長、分化和繁殖的第一步，材料表面的物理化學性質(zhì)是影響細胞黏附的主要因素。多項研究證實，層層自組裝功能化改性的鈦表面攜帶活性分子，能調(diào)控種植體表面細胞黏附、增殖、分化、生物行為[4,30,34-35]。但也有研究顯示，鈦合金(TiAl6V4)表面的低聚電解質(zhì)膜對成骨細胞的增殖和分化無明顯作用。
4.鈦表面的抗菌作用
種植體表面抗菌，防止細菌膜形成是預防種植失敗的有效方法之一。早期研究證實，在玻璃表面引入殼聚糖-透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)膜后，可減少80%的腸桿菌黏附[37]。同樣，鈦表面的殼聚糖-透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)膜能長時間保持鈦表面抗菌性，減少種植感染概率[38]。用脂質(zhì)體與天然聚電解質(zhì)構建的載銀離子聚電解質(zhì)膜，也可達到長效抗菌的目的[39]。
種植體表面改性包括物理、化學、仿生化改性。種植體表面改性的趨勢是表面仿生化改性，將生物大分子固定于種植體表面，促進骨整合。但生物大分子的固定、緩釋控釋和生物活性保持是表面仿生化改性的難點，層層自組裝技術的優(yōu)勢在于其不但可在鈦表面裝載更多種類和數(shù)量的生物大分子，而且還可通過聚電解質(zhì)膜的降解達到緩釋控釋的目的，同時組裝流程簡單可控并有優(yōu)越的薄膜調(diào)控功能，因此，層層自組裝技術是一種前景可觀的鈦表面改性方法。
目前鈦表面形成聚電解質(zhì)膜的驅(qū)動力多是經(jīng)典的靜電相互作用力，但氫鍵、共價鍵、配位鍵等自組裝技術已引起越來越多的學者的重視。層層自組裝技術的主要問題在于目前的研究均是針對自組裝制備、結構、功能的研究，缺乏對聚電解質(zhì)膜和自組裝技術的機制研究。未來層層自組裝技術的研究熱點將從單純生物分子活性固定、控釋，轉向模擬構建細胞外基質(zhì)化學、物理和生物多元結構方向發(fā)展；同時層層自組裝的組裝機制及規(guī)律也是自組裝技術研究的重要領域之一。
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（注，原文標題：聚電解質(zhì)多層膜在鈦表面改性中的應用）
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